楊茂君實(shí)驗(yàn)室全體成員合影

楊茂君團(tuán)隊(duì)發(fā)表在《細(xì)胞》雜志網(wǎng)站的照片

豬源呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物中等分辨率三維結(jié)構(gòu)(局部)

豬源超級(jí)復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)(局部)

瘧原蟲(chóng)Ndh2二聚體的高分辨率三維結(jié)構(gòu)(局部)

人源呼吸鏈超超級(jí)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模型(局部)

從基質(zhì)側(cè)觀察的ATP合成酶四聚體的結(jié)構(gòu)(局部)

楊茂君教授很滿意自己的微信頭像，作為清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授，做線粒體呼吸鏈研究十余年，他把一張滿是中國(guó)元素“飛龍”的圖片做成頭像，圖畫(huà)中奔騰的“二龍”：一條是年畫(huà)中威武的“中國(guó)龍”，另一條“龍”由呼吸鏈中蛋白質(zhì)機(jī)器的三維圖“幻化”而成(左圖)。

在接受科技日?qǐng)?bào)記者采訪時(shí)，楊茂君表示，這張圖是發(fā)表在國(guó)際頂級(jí)期刊《細(xì)胞》雜志網(wǎng)站首頁(yè)的照片，它代表著所在團(tuán)隊(duì)在生命科學(xué)領(lǐng)域取得的一項(xiàng)突破性成果。

呼吸，是生命的體征和原動(dòng)力，人無(wú)時(shí)無(wú)刻不在呼吸，呼吸作用主要由位于線粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物完成，對(duì)線粒體呼吸鏈的研究一直都是生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。1978年P(guān)eter D.Mitchell因提出線粒體呼吸鏈的化學(xué)滲透假說(shuō)，1997年John E.Walker因闡明三磷酸腺苷(ATP)合成酶的三維結(jié)構(gòu)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng);日前，William G.Kaelin等科學(xué)家因發(fā)現(xiàn)了氧氣感知通路(生命體對(duì)缺氧和富氧做出不同反應(yīng)的分子機(jī)制)獲得了2019年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

早在2008年剛回國(guó)組建實(shí)驗(yàn)室時(shí)，楊茂君教授就認(rèn)定了線粒體呼吸鏈這個(gè)研究方向。當(dāng)時(shí)，處于呼吸鏈上游的超級(jí)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及功能的研究，在我國(guó)還相對(duì)比較落后，面對(duì)這塊難啃的“骨頭”，他偶爾也會(huì)感嘆“前路漫漫”。

經(jīng)過(guò)十年如一日的潛心研究，楊茂君團(tuán)隊(duì)在這條探索之路上終于取得了一系列成果：攻克了哺乳動(dòng)物線粒體呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物的原子分辨率結(jié)構(gòu)這一難題;首次從體外培養(yǎng)的人源細(xì)胞中分離、純化出高純度的呼吸鏈蛋白復(fù)合物，并且首次發(fā)現(xiàn)并解析了人源超超級(jí)復(fù)合物I2III2IV2的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究成果“線粒體呼吸鏈蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究”獲得了2018年度北京市科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)。

首次解析呼吸鏈超超級(jí)復(fù)合物高分辨率結(jié)構(gòu)

什么是呼吸鏈呢?

線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所，是細(xì)胞的“動(dòng)力車間”，細(xì)胞生命活動(dòng)所需的能量，大約95%來(lái)自線粒體。線粒體里面有一層褶皺很多的內(nèi)膜，內(nèi)膜上有生產(chǎn)能量的“機(jī)器”——蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在內(nèi)膜上完成氧氣、電子、質(zhì)子等物質(zhì)的“搬運(yùn)”“安裝”等工作，這條產(chǎn)生能量的“流水線”被稱為呼吸鏈。楊茂君教授團(tuán)隊(duì)所做的，正是將這些“機(jī)器”的“配件”一點(diǎn)點(diǎn)拆解開(kāi)來(lái)，并為其畫(huà)出精細(xì)的結(jié)構(gòu)。

想要研究呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物的功能，首先要能夠看清它的“模樣”。前人的研究表明，呼吸作用由位于線粒體內(nèi)膜上的4種呼吸鏈蛋白復(fù)合物分步完成。這四種蛋白復(fù)合物分別為復(fù)合物I(NADH脫氫酶)、復(fù)合物II(琥珀酸脫氫酶)、復(fù)合物III(細(xì)胞色素c還原酶)和復(fù)合物IV(細(xì)胞色素c氧化酶)。

“復(fù)合物并不是單獨(dú)存在，而是以不同的形式組合形成超級(jí)復(fù)合物，由于目前很多復(fù)雜的大分子物質(zhì)難以獲得晶體，X射線晶體學(xué)成像便無(wú)法獲得其高分辨率結(jié)構(gòu)，因此需要借助最新科技成果——冷凍電鏡技術(shù)來(lái)幫忙。”楊茂君教授說(shuō)道，“通過(guò)篩選、添加大量活性小分子化合物，我們開(kāi)發(fā)并優(yōu)化了蛋白純化新方法，最終獲得了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、均一性好、純度較高的豬源線粒體超級(jí)復(fù)合物，借助單顆粒冷凍電鏡技術(shù)，解析了超級(jí)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，整體分辨率達(dá)到3.6到4.0埃，可以觀測(cè)到蛋白質(zhì)亞基之間復(fù)雜而細(xì)致的相互作用，并利用此方法獲得了人源呼吸鏈超超級(jí)復(fù)合物(I2III2IV2，由2個(gè)復(fù)合物I、1個(gè)復(fù)合物III的二聚體、2個(gè)復(fù)合物IV和2個(gè)細(xì)胞色素c蛋白組成)的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。”這是當(dāng)時(shí)世界上所解析的最大、也是最復(fù)雜的膜蛋白超級(jí)復(fù)合物結(jié)構(gòu)，為人類深入理解哺乳動(dòng)物呼吸鏈復(fù)合物的組織形式、分子機(jī)理以及治療細(xì)胞呼吸相關(guān)的疾病提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。相關(guān)研究成果已發(fā)表在國(guó)際頂級(jí)期刊《自然》《細(xì)胞》上。

基于獲得的高分辨率結(jié)構(gòu)，楊茂君教授提出了全新的電子傳遞機(jī)制，新提出的電子傳遞模型考慮到了超級(jí)復(fù)合物的存在形式，整個(gè)過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生超氧自由基，并且具有更高的電子傳遞效率，從能量轉(zhuǎn)換的角度來(lái)說(shuō)對(duì)能量的利用更加高效，從結(jié)構(gòu)上考慮也更加合理。目前，這一理論還處于假設(shè)階段，需要后續(xù)更加精細(xì)的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)其加以驗(yàn)證。

如何利用解析出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研發(fā)靶向藥物，治療呼吸鏈異常引起的疾病，讓科學(xué)研究為人類的健康服務(wù)也是目前研究的重點(diǎn)。楊茂君教授告訴記者：“由于II型復(fù)合物I只存在于低等生物中，所以它被認(rèn)為是一種很好的對(duì)抗病原體的特異性靶標(biāo)分子。例如，瘧疾是受到全球關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，通過(guò)篩選，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)存在兩種化合物可以與靶蛋白共結(jié)晶，而且對(duì)細(xì)胞毒性較低。其與青蒿素有協(xié)同抗瘧疾作用，因此具有與青蒿素聯(lián)合用藥發(fā)展新的瘧疾治療方法的潛能。該工作為抗瘧疾藥物研發(fā)提供了重要信息，依據(jù)該信息的抗瘧疾藥物也正在研發(fā)之中。”

科學(xué)研究要不唯書(shū)、不唯上、只唯實(shí)

認(rèn)真觀察、大膽假設(shè)、小心求證是獲得原創(chuàng)性突破成果的“三大法寶”。論文發(fā)表后，楊茂君教授時(shí)常端詳這組復(fù)合物，復(fù)合物I、III、IV像樂(lè)高玩具的組件一樣被拼插在一起。

“我發(fā)現(xiàn)這里空著。”楊茂君教授一邊指一邊對(duì)記者說(shuō)，復(fù)合物III伸出一只“手臂”，“經(jīng)過(guò)億萬(wàn)年的進(jìn)化，生物體不可能讓另一邊這樣浪費(fèi)著，肯定還有沒(méi)被發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)”。

楊茂君教授富有創(chuàng)意地用“中國(guó)龍”圖案來(lái)代替未被揭秘的對(duì)稱面，這正是發(fā)表在《細(xì)胞》上的論文配圖的由來(lái)。

楊茂君教授相信這一研究可以更進(jìn)一步，但是線索在哪兒?

“對(duì)稱才是美的，伸出的這邊很可能結(jié)合著其他的復(fù)合物。”楊茂君教授決定重新純化復(fù)合物IV，“拿到密度圖之后，我仔細(xì)分析了各個(gè)亞基的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)13個(gè)亞基都吻合匹配，只是在原來(lái)認(rèn)為結(jié)合另一個(gè)復(fù)合物IV形成二聚體的界面上出現(xiàn)一團(tuán)‘不明物體’。通過(guò)建立模型，進(jìn)行匹配，發(fā)現(xiàn)那團(tuán)‘不明物體’是亞基NDUFA4。在以往純化復(fù)合物IV時(shí)，亞基NDUFA4由于超強(qiáng)去垢劑的加入而無(wú)法穩(wěn)定結(jié)合。”

至此，復(fù)合物IV的謎底終于被揭開(kāi)。“正確的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，能夠讓我們更加清晰地了解電子傳遞的路徑。在復(fù)合物IV的反應(yīng)中心，氧氣生成了水，同時(shí)另一部分質(zhì)子(H+)被直接泵入線粒體膜間隙中留作他用。”楊茂君說(shuō)，“在漫長(zhǎng)的研究過(guò)程中，我們每天面對(duì)的不是成功的喜悅，而是各種失敗，但正是在失敗的基礎(chǔ)上逐漸發(fā)現(xiàn)真相的過(guò)程，才最讓人興奮。”

科學(xué)家要為人類健康和未來(lái)發(fā)展思考

對(duì)線粒體呼吸作用的研究不僅具有重要的科學(xué)意義，而且有助于攻克多種嚴(yán)重的綜合性疾病。

“人類線粒體呼吸鏈系統(tǒng)異常會(huì)導(dǎo)致多種疾病，例如，阿爾茨海默綜合征、帕金森綜合征、多發(fā)性硬化等，我們的研究成果為這些疾病提供了一種治療的可能性，希望我們的研究最終能夠被轉(zhuǎn)化成治病救人的藥物。”楊茂君教授對(duì)記者說(shuō)道，越深入地了解蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)，越能夠參透生命體的運(yùn)轉(zhuǎn)。“通過(guò)研究，我們可以明確知道哪個(gè)原子出了問(wèn)題，并設(shè)計(jì)藥物有的放矢地干預(yù)疾病，以達(dá)到治療效果。”

研究團(tuán)隊(duì)目前正在對(duì)已經(jīng)上市的1400多種藥物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有56種藥物的作用靶點(diǎn)在呼吸鏈上。

“例如，呋塞米能促進(jìn)細(xì)胞呼吸，提高氧氣利用效率，是目前最有效的抗高原反應(yīng)藥物，其作用靶點(diǎn)正是在呼吸鏈上。病人在服用有些藥物后會(huì)產(chǎn)生心悸、無(wú)力等副作用，這些發(fā)現(xiàn)可以幫助科學(xué)家改進(jìn)藥物，以消減其副作用。”楊茂君教授表示。

在楊茂君教授內(nèi)心深處，有一個(gè)終極夢(mèng)想：通過(guò)科學(xué)研究，實(shí)現(xiàn)人體溫度的調(diào)控，以延長(zhǎng)人的壽命。“假如某人患上醫(yī)學(xué)領(lǐng)域某種目前還不能被治愈的疾病，可以選擇把他的體溫降下來(lái)，維持基礎(chǔ)代謝，讓他進(jìn)入睡眠狀態(tài)。過(guò)20年，這個(gè)病能治了，再讓他蘇醒，接受更好的治療。”他對(duì)記者說(shuō)道。

之所以有這樣的終極夢(mèng)想，楊茂君教授表示，并不是天馬行空，人體體溫?zé)崃恐饕獊?lái)源于線粒體，實(shí)現(xiàn)這個(gè)夢(mèng)想的突破口就在線粒體的研究上。

呼吸是機(jī)體最基本的生命活動(dòng)，最為平常卻又十分神秘，揭開(kāi)呼吸鏈超級(jí)復(fù)合物的“廬山真面目”，探索自身生命活動(dòng)的規(guī)律，是人類醫(yī)藥健康發(fā)展歷史上一個(gè)永恒的話題。

關(guān)鍵詞： 呼吸鏈 超級(jí)復(fù)合物 科學(xué)技術(shù)